Mesenchymal stem cells promote hepatocarcinogenesis via lncRNA-MUF interaction with ANXA2 and miR-34a

间充质干细胞通过lncRNA-MUF与ANXA2和miR-34a相互作用促进肝癌发生

期刊：CancerResearch；影响因子：9.13            

发表单位：北京工业大学 

    间充质干细胞有助于肝细胞癌的发展和转移，那么在发展和转移过程中是否有lncRNA发挥作用呢，本研究通过lnc表达谱发现lncRNA-MUF发挥重要作用，机制上lncRNA-MUF既可以直接与蛋白ANXA2结合激活Wnt/β-catenin信号和EMT通路，另外，lncRNA-MUF可以竞争性结合miR-34a发挥ceRNA作用上调Snail1表达，促进EMT过程。

    越来越多的证据表明癌症相关的间充质干细胞（MSC）有助于肝细胞癌（HCC）的发展和转移。我们鉴定了一种新的lncRNA，我们称之为lncRNA-MUF，其在HCC组织中高度表达并且与不良预后相关。在HCC细胞中敲低lncRNA-MUF抑制EMT并抑制其致瘤潜力。相反，lncRNA-MUF过表达加速了EMT和恶性能力。机理研究表明，lncRNA-MUF结合膜联蛋白A2（ANXA2）并激活Wnt/β-catenin信号和EMT。此外，lncRNA-MUF充当miR-34a的竞争性内源RNA（ceRNA），导致Snail1上调和EMT活化。

    肝细胞癌（HCC）是全球第五大常见癌症，也是全球癌症相关死亡的第三大原因。越来越多的证据表明，lncRNA可通过多种机制参与许多生理或病理过程，包括RNA-蛋白或RNA-RNA相互作用。据报道，失调的lncRNA可调节HCC增殖，转移和复发。然而，lncRNA在MSC介导的肝癌发生中的作用仍然未知。

    癌症相关的MSCs作为肿瘤微环境的重要组成部分正日益受到重视，但HCC-MSCs在HCC进展中的作用报道较少。在这里，我们发现HCC-MSCs通过Transwell共培养系统显著增强HCC细胞的肿瘤球形成。我们研究了HCC-MSC与HCC细胞（GFP）之间相互作用的影响。流式细胞术分析显示癌症干细胞（CSC）标志物如CD90和CD13被HCC-MSC显著诱导。为了进一步评估体内HCC-MSC的CSC促进作用，通过在裸鼠中皮下接种荧光素酶标记的SMMC-7721细胞，与HCC-MSC混合或不与HCC-MSC混合，进行有限稀释致瘤性测定。

    当皮下接种1×106个SMMC-7721或HepG2细胞时，HCC-MSC共接种组中的肿瘤重量显著增强。此外，肝脏部位的生物发光强度和转移性结节均表明HCC-MSC显著促进体内转移。这些结果提供了强有力的证据，表明当与HCC-MSC共培养时，HCC细胞转变为更具攻击性的表型。

    为了解HCC-MSCs如何促进HCC进展的机制，我们使用微阵列分析来评估与HCC-MSC共培养的HCC细胞中lncRNA和mRNA的变化（图2A）。转录组谱分析鉴定出当与HCC-MSC共培养时，57个lncRNA转录物（图2B）和110个mRNA在三种不同的HCC细胞系中差异表达。转录组数据已经保存在Gene Expression Omnibus（GEO）数据库（GSE86160）中。到目前为止，大多数lncRNA仍然没有表征，我们首先研究了由HCC-MSC诱导的HCC细胞的改变的mRNA。基因集富集分析（GSEA）和基因本体论（GO）均表明差异表达的mRNA富含细胞外基质，与EMT信号传导和转移密切相关。另外，qPCR和蛋白质印迹试验证实，HCC-MSC条件培养基显著上调EMT相关基因。TGF-β1是一种表征良好的EMT诱导剂，可作为阳性对照。我们的研究结果表明，HCC-MSCs可能通过EMT过程在很大程度上促进HCC恶性肿瘤。

    为了进一步鉴定哪些lncRNA可能在促进HCC进展的HCC-MSC中起重要作用，使用以下标准筛选候选lncRNA：lncRNA微阵列中的HCC-MSC显著改变的lncRNA（图2B）;和癌症基因组图谱（TCGA）数据库表明与邻近的非肿瘤组织相比，HCC样本中lncRNA的差异表达（图2C）。在五种最差异表达的lncRNA中，新的lncRNA（LINC00941，EnsemblID：ENSG00000235884，倍数变化>5和P<0.01）特别引起我们的注意（图2D）。由于这是一种无特征的lncRNA，我们将其称为lncRNA-MUF。与微阵列结果一致，qPCR测定证实HCC-MSC在HCC细胞中lncRNA-MUF显著上调。另外，与邻近的非肿瘤组织相比，它在HCC样本中高度表达（图2E）。TCGA数据（图2F）和我们之前的lncRNA微阵列证实了这些结果。值得注意的是，Kaplan-Meier生存分析表明高lncRNA-MUF表达与HCC患者的不良生存相关（图2F）。此外，HCC-MSC条件培养基和TGF-β1显著增强了lncRNA-MUF的表达（图2G）。此外，lncRNA-MUF在肿瘤球和高侵袭性HCC细胞中高度表达（图2G）。总之，这些发现表明lncRNA-MUF被HCC-MSC显著上调。

    通过cDNA末端测定（RACE）的5'和3'快速扩增确定1884碱基对（bp）转录物，并且显示无编码潜力，如通过CNCI，CPAT和PhyloCSF评分分析所确定的。细胞组分和RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）分析表明lncRNA-MUF定位于细胞质中。敲除lncRNA-MUF显著减弱了体外肿瘤球形成和侵袭的能力。此外，lncRNA-MUF敲低显著抑制了体内皮下异种移植物形成和转移能力。相反，在lncRNA-MUF过表达细胞中肿瘤球形成增加。鉴于HCC-MSCs刺激EMT过程，我们检测了lncRNA-MUF改变后EMT相关基因的表达。qPCR和蛋白质印迹均证明lncRNA-MUF敲低显著抑制间充质相关基因的表达，而lncRNA-MUF过表达具有相反的作用。总之，这些数据表明lncRNA-MUF可以调节EMT程序以促进HCC进展。

    LncRNAs可通过RNA-蛋白质相互作用发挥功能，调节靶基因。因此，我们利用RNA pull-down测定，然后银染和质谱（MS）来鉴定lncRNA-MUF-蛋白相互作用。发现ANXA2特异性结合lncRNA-MUF。通过RNA pull-down测定然后进行蛋白质印迹，在生物素标记的有义lncRNA-MUF组中检测到ANXA2。此外，通过RNA免疫沉淀（RIP）测定验证了lncRNA-MUF和ANXA2之间的相互作用。另外，构建一系列截短的lncRNA-MUF以绘制lncRNA-MUF和ANXA2之间的特异性结合区域，表明lncRNA-MUF的核苷酸800至1600可以结合ANXA2。竞争性RNA pull-down测定进一步证实了ANXA2与lncRNA-MUF的相互作用。此外，RNA-FISH和免疫荧光测定表明lncRNA-MUF与ANXA2在HCC细胞的细胞质中共定位。GEO数据显示ANXA2在HCC组织和转移样品中高度表达。ANXA2的消耗显著抑制肿瘤球形成和致肿瘤性。这些数据表明lncRNA-MUF-ANXA2轴可以调节HCC进展。

    为了研究lncRNA-MUF-ANXA2轴促进HCC进展的机制，我们检查了ANXA2改变后EMT相关基因的表达。通过ANXA2过表达或敲低显著改变间充质相关基因和β-连环蛋白。不同细胞区室中的β-连环蛋白介导不同的细胞功能，因此我们确定ANXA2是否影响β-连环蛋白的亚细胞分布。蛋白质印迹分析显示过表达ANXA2的细胞的胞质溶胶和细胞核中β-连环蛋白的增加。相反，在ANXA2敲低细胞中，细胞核中的β-连环蛋白显著降低。此外，我们研究了lncRNA-MUF的效果在GSK-3β和ANXA2之间的相互作用，并发现lncRNA-MUF的敲低抑制ANXA2对β-catenin和EMT相关蛋白的促进作用。另外，co-IP测定证实，lncRNA-MUF过表达显著增强ANXA2和GSK-3β之间的相互作用，而lncRNA-MUF消耗抑制结合效应。对lncRNA-MUF截短的分析表明，GSK-3β而非β-连环蛋白与lncRNA-MUF的核苷酸800至1200结合，表明lncRNA-MUF通过不同但部分重叠的结构域与ANXA2和GSK-3β相互作用。总之，lncRNA-MUF和ANXA2的结合在Wnt /β-连环蛋白信号传导和EMT过程的激活中起重要作用。

    新出现的证据表明，细胞质lncRNA可以作为调节miRNA功能的ceRNA。为了检查细胞质定位的lncRNA-MUF是否可以结合内源性miRNA，我们使用PITA和RNAhybrid软件预测了靶miRNA。仅选择具有高等级靶位点和在HCC组织中低表达的miRNA用于进一步分析。RIP和RNA pull-down测定显示，与对照相比，miR-34a和miR-133a在lncRNA-MUF组中显著富集。我们的初步结果显示miR-34a比miR-133a更显著地抑制肿瘤球形成。因此，我们主要关注lncRNA-MUF与miR-34a结合的影响。荧光素酶活性和AGO2RIP测定显示lncRNA-MUF可与miR-34a结合。此外，RNA-FISH分析证明lncRNA-MUF与HCC细胞的细胞质中的miR-34a共定位。接下来，我们发现miR-34a抑制肿瘤球形成和HCC细胞的肿瘤生长。此外，当lncRNA-MUF和miR-34a共转染到HCC细胞中时，lncRNA-MUF显著地挽救了miR-34a对肿瘤球形成和侵袭的抑制作用。此外，qPCR和蛋白质印迹分析显示lncRNA-MUF可以恢复miR-34a对EMT过程的抑制作用。这些数据表明在HCC细胞中lncRNA-MUF作为影响miR-34a功能的ceRNA。

    为了进一步阐明lncRNA-MUF-miR-34a轴对HCC进展的贡献的机制，Target Scan软件预测Snail1是miR-34a的靶标之一。并且miR-34a显著抑制Snail1在HCC细胞中的表达，荧光素酶报告基因测定表明miR-34a可以结合Snail1的3'非翻译区（UTR）。重要的是，lncRNA-MUF减弱了miR-34a与Snail1的3'UTR的结合能力。此外，Western印迹分析证实，lncRNA-MUF可降低miR-34a对Snail1表达的抑制作用。另外，Snail1敲低抑制由lncRNA-MUF过表达诱导的肿瘤球形成。qPCR和蛋白质印迹分析证明Snail1敲低抑制了lncRNA-MUF对EMT进展的促进作用。总之，这些数据显示lncRNA-MUF可以作为miR-34a的ceRNA起作用以调节Snail1的表达并增强EMT过程。

    在这项研究中，我们研究了lncRNAs在促进HCC进展的HCC-MSCs中的作用。有趣的是，我们发现HCC-MSC在HCC细胞中新的lncRNA-MUF显著增加。此外，lncRNA-MUF显著促进肿瘤发生和EMT特征。在机理上，lncRNA-MUF与ANXA2和miR-34a相互作用以参与EMT过程和肿瘤发生。总的来说，该研究的结果提供了一种新的机制，通过该机制，HCC-MSC促进HCC进展。

其他相关文献解读

文献解读：lncRNA ceRNA机制怎么找分子

文献解读：Advanced Science：lnc, miRNA, mRNA关系一定是ceRNA吗

文献解读：Nature Cell Biology: lncRNA ceRNA调控胃癌EMT过程（IF:19.064）