Exosomes from BM-MSCs increase the population of CSCs via transfer of miR-142-3p

骨髓间充质干/基质细胞的外泌体转移miR-142-3p增加结肠癌干细胞的数量

    期刊：Br. J. Cancer；影响因子：5.922

    发表单位：中国医科大学

    骨髓间充质干/基质细胞（BM-MSCs）衍生的外泌体通过miR-142-3p促进结肠癌干细胞样特性

    从BM-MSCs中分离外泌体，并使用这些外泌体来治疗结肠癌细胞。通过细胞表面标记（CD133和Lgr5）和功能测定、基因靶标的功能和分子分析发现BM-MSC衍生的外泌体含有不同的microRNA，包括miR-142-3p，这反过来又增加了结肠癌细胞中CSCs的数量。从BM-MSC衍生的外泌体中敲低miR-142-3p明显降低了结肠CSC的数量。机理上，发现Numb是miR-142-3p的靶基因，并且miR-142-3p通过下调Numb促进Notch信号传导通路。

    骨髓间充质干/基质细胞（BM-MSCs）是显示迁移至肿瘤并参与肿瘤微环境的祖细胞。BM-MSCs通过释放细胞因子或外泌体在肿瘤过程中发挥重要作用;然而，BM-MSCs如何影响结肠癌细胞中CSC的干性仍然知之甚少。

    从健康个体获得的人骨髓细胞中分离人BM-MSC。通过流式细胞仪评估的BM-MSC的纯度>95％。贴壁细胞显示出均匀的成纤维形态。在第6代（P6）BM-MSCs具有均一的表面标志物，并且对于间充质标记物（CD44，CD73，CD90和CD105）呈阳性，对造血和内皮标记物（CD34，CD11b，CD19，CD45）和HLA-DR呈阴性。P6 BM-MSC的纯度约为87.4％。

    通过标准超速离心分离了源自BM-MSC的外泌体。通过粒度分析仪证明了BM-MSC衍生的外泌体的大小范围为3.6-140nm。通过免疫电子显微镜确认外泌体对已知的外泌体标记CD63，CD81和RAb5A呈阳性。外泌体对CD63，CD81，Rab5A，CD9和HSP70的表达呈阳性，并且通过蛋白质印迹对细胞色素c的表达呈阴性。

    用来自BM-MSC的条件培养基的外泌体处理结肠癌细胞。当用外泌体处理结肠癌细胞时，进行FCM发现CD133+和Lgr5+结肠癌细胞的表达水平增加，集落形成测定显示集落数增加，结肠癌细胞中干细胞标志物的表达增加。细胞侵袭和致肿瘤性测定发现用外泌体处理的结肠癌细胞显著增加细胞侵袭和致肿瘤性。BM-MSC衍生的外泌体也促进细胞粘附，对doxorubicin也表现出更大的抗药性。表明，来自BM-MSCs的外泌体在促进结肠癌细胞的干性中起着关键作用。

    从microRNA阵列中，我们鉴定出50个microRNA，其中BM-MSCs衍生的外泌体增加了3倍以上。从50种microRNA中选择了miR-142-3p，这是唯一一种促进结肠癌干细胞样球形成和CD133和Lgr5表达的microRNA。使用定量实时PCR，我们证实来自用BM-MSC衍生的外泌体处理的结肠癌细胞的外泌体的miR-142-3p的丰度大于单独的结肠癌细胞。

    用miR-142-3p慢病毒或对照慢病毒转染三种结肠癌细胞发现用miR-142-3p转染的三种癌细胞比用对照转染的细胞具有更大比例的CD133和Lgr5阳性细胞。BM-MSC衍生的外泌体中结肠癌细胞中干细胞标志物的表达增加。原位注射小鼠肠壁实验发现miR-142-3p在体内抑制HT-29和SW-480结肠癌细胞的原发性肿瘤中的肿瘤增殖。表明BM-MSC衍生的外泌体可能通过miR-142-3p促进肿瘤的进展。

    使用TargetScan来确定miR-142-3p靶基因并鉴定了与CSC信号传导通路相关的几种靶基因。通过生信分析，选择Numb作为结肠癌中的miR-142-3p的的靶基因。双荧光素酶报告基因测定显示miR-142-3p的可以直接结合Numb的3'UTR，而突变体3'UTR没有观察到差异。定量实时PCR发现转染miR-142-3p的结肠癌细胞中的Numb表达显著降低。蛋白质印迹表明miR-142-3p转染的结肠癌细胞中Numb的丰度降低。此外，抑制Numb的表达促进的Notch靶基因表达，在miR-142-3p-过表达的结肠癌细胞中逆转Numb也可以抑制Notch信号。

    使用antagomiR-142-3p，我们降低了BM-MSCs外泌体中miR-142-3p的表达。用来自antagomiR-142-3p转染的BM-MSC或对照antagomiR转染的BM-MSC的外泌体处理结肠癌细胞。结果显示，antagomiR-142-3p可下调结肠CSCs的数量。与对照antagomiR相比，antagomiR-142-3p疗法相对减少细胞侵袭和粘附。耐药性测定显示，与来自BM-MSC的外泌体相比，antagomiR-142-3p外泌体可显著抑制结肠癌细胞的细胞活力。表明从BM-MSCs的外泌体中剥夺miR-142-3p可以减弱外泌体对结肠癌细胞的作用。

    总之，我们的工作揭示了BM-MSC衍生的外泌体调节结肠癌进展的能力争论领域。这些数据阐明了BM-MSC衍生的外泌体通过miR-142-3p促进CSC表型的功能。我们的研究结果以及该领域的其他研究表明，BM-MSCs是更通用的细胞，通过细胞因子或外泌体对结肠CSCs表型，肿瘤形成，侵袭和化疗耐药性有贡献。

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