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Cells respond to deletion of CAV1 by increasing synthesis of extracellular matrix
Cells respond to deletion of CAV1 by increasing synthesis of extracellular matrix
细胞通过增加细胞外基质的合成来响应CAV1的缺失
期刊：PLoS ONE；发表单位：英国剑桥医学研究委员会分子生物学实验室
导 读
许多老师做过RNAseq、芯片实验，通过分析得到了许多数据，这些数据该怎么看，怎么使用，在文章中该怎么写，或许是许多老师所疑惑的。我们将通过文献对RNAseq中涉及的各种分析，各种图表进行解读，以供老师在数据分析及文章撰写时参考。一起来看看本篇RNAseq实验怎么使用的这个数据吧！
文章摘要
一系列细胞功能归因于细胞膜穴样内陷，即质膜的烧瓶状内陷。caveolin 1敲除引起穴样内陷消失，在这里，我们使用RNA-seq技术对caveolin 1敲除小鼠的原代胚胎成纤维细胞和正常对照进行基因表达谱分析，从而洞察细胞对细胞膜穴样内陷的缺失作出的反应。与对照相比时，GO富集分析term“细胞外基质”相关基因显著高表达。
RNAseq相关实验
RNA-seq材料：WT、CAV1-/-小鼠分离胚胎细胞，每组4个重复。
RNA-seq 实验：按照说明书（TruSeq Stranded mRNA LT，Illumina）制备测序文库。简而言之，将3'末端腺苷酸化，连接衔接子，并在两端用衔接子对DNA片段进行PCR富集。使用KAPA Library Quantification试剂盒（Roche）在Applied Biosystem Vii7仪器中通过定量验证文库，并且质量控制是使用Agilent Bioanalyzer和Agilent DNA array完成。将索引文库归一化并合并，并使用HiSeq平台（Illumina）进行测序，进行单端50bp reads。
RNA-seq数据处理和分析：通过TopHat2 v2.0.13将reads与GRCm38小鼠转录组（-nocoverage-search，-library-type=fr-firststrand，-transcriptome-index）对齐。Cufflinks套件v2.2.1（-library-type=fr-firststrand，-frag-bias-correct，-m-read-correct）用于量化转录本，q<0.05筛选差异表达的基因。
RNAseq相关结果
测序reads比对到39707个基因上，16420个（41％）被定义为“表达”，其表达水平FPKM>1.0。在表达的基因中，我们发现103个蛋白质编码基因显著差异表达（q<0.05）。WT和CAV1-/-MEF组显著差异表达的基因显示在表1和2中。
Panther基因分类系统（www.pantherdb.org）对基因的亚细胞定位进行分类（图1A）（注：此处是常用的GO富集中“细胞组分(cellular component)”，用的软件不同而已）。
所有差异进行GO富集分析细胞组分显著富集到是蛋白质性细胞外基质“proteinaceous extracellular matrix”，细胞外区域“extracellular region”和细胞外空间“extracellular space”。当仅分析CAV1-/-MEF上调的基因时，蛋白质性细胞外基质“proteinaceous extracellular matrix”，细胞连接“cell junction”，细胞外基质“extracellular matrix”，细胞外区域“extracellular region”和细胞外空间“extracellular space”显著富集到，实际上这些术语包含了46个上调基因中的22个（图1B）。当仅分析下调的基因时，具有较少的明显整体模式，尽管具有术语中间丝细胞“intermediate filament”，骨架“cytoskeleton”的基因被过度表达（图1C）。因此，我们的RNA-seq分析得出的一个明确结论是细胞外基质（ECM）成分的基因在CAV1-/-MEF中上调。
RNAseq实验总结
本研究主要查看细胞膜穴样内陷消失后哪些基因发生了差异表达，并且明确这些差异表达的基因位于细胞的哪个位置。通过RNAseq实验可以筛选差异表达的基因，通过GO富集分析可以了解基因显著富集的位置，当然GO富集分析可以知道差异基因显著富集的分子功能（Molecular Function）、生物过程（Biological Process），此文章没有用到，没有写出。文章展示RNAseq的数据，放置了基因差异表达列表（也可以放热图嘛）和GO富集分析经典的柱状图，以说明穴样内陷消失引起分子层面基因的变化，以及基因富集到细胞外基质，文章还通过qPCR, WB, 免疫组化等对重要基因进行了验证。
上海生因生物专业提供基因组测序、微生物测序、转录组测序（RNAseq），高通量测序数据标准分析、个性化分析，各类图表绘制，及GEO、TCGA数据挖掘服务。有需要的联系我们。
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