Synthetic Circular RNA Functions as a miR-21 Sponge to Suppress Gastric Carcinoma Cell Proliferation

合成环状RNA作为miR-21海绵抑制胃癌细胞增殖

    期刊：Molecular Therapy-Nucleic Acids；影响因子：5.660

    发表单位：西安交通大学

    合成circRNA可以作为miR-21海绵抑制胃癌的进展。

    我们假设合成的circRNA海绵可以实现针对特定miR的治疗性功能丧失。然后经过试验得出，可以使用简单的酶促连接步骤合成对核酸酶消化具有抗性的人工circRNA海绵。这些海绵抑制癌细胞增殖并抑制miR-21对下游蛋白质靶标的活性。总之，合成的circRNA海绵代表了一种简单，有效，方便的策略，用于在体外实现miR功能的靶向丧失，并且在人类患者中具有潜在的未来治疗应用。.

    胃癌（GC）仍然是全球第五大常见癌症，也是癌症死亡的第三大原因。大多数GC病例在晚期诊断，结果不良，治疗效果受到很大限制。进行细胞毒性化疗。幸运的是，随着我们对胃分子癌发生的深入理解，目前正在发现基于分子靶向治疗的2种新的潜在治疗策略。

    基于来自癌症基因组图谱（TCGA）中的446个GC和45个正常样品的miR序列数据，鉴定了185个异常表达的miR，其中137个上调，48个下调。miR-21，我们感兴趣的miR，在GC中比正常样品上调1.76倍。

    使用TaqMan qRT-PCR分析，相对于正常胃上皮细胞系HFE145，我们发现miR-21在NCI-N87、KATOIII、AGS、MKN28中显著过表达。我们选择NCI-N87，AGS和MKN28进行后续研究，因为miR-21的表达水平高于KATOIII细胞。

    我们的体外RNA环化策略使用含有5个重复miR凸起结合位点的合成线性RNA的酶促连接。通过RT-PCR和Sanger测序验证了circRNA海绵的精确构建。RT-PCR结果证实，不同引物仅从环状（scRNA21）模板RNA产生预期的100-nt产物，而不是从相应的线性（LRNA21）模板RNA产生。相反，会聚引物从圆形和线性RNA模板产生预期产物。此外，头部到尾部的circRNA连接点仅在scRNA21产生的不同PCR产物中得到验证。在由LRNA21和scRNA21海绵产生的会聚PCR产物中验证了五个重复的miR-21凸起（错配）结合位点。在阴性对照杂乱的circRNA中也证实了头对尾连接和五个重复的杂乱位点。

    将核酸酶介导的scRNA21海绵降解的抗性与其线性对应物LRNA21的抗性进行比较，首先使用胎牛血清（FBS）介导的降解。30分钟后，LRNA21在4％FBS中降解92％。相反，scRNA21显著更稳定，30分钟后仅降低9％。事实上，scRNA21仅在FBS中以7％或更高的浓度降解。然后在用特异性外切核酸酶RNase R消化后比较环状和线性RNA的稳定性。LRNA21分别用1或3U RNase R/1μgRNA降解94％或97％；相反，scRNA21仅降低9％或14％。

    在共转染后24小时测定NCI-N87，AGS和MKN28 GC细胞中的标准化萤火虫荧光素酶活性，发现在所有三种细胞系中观察到降低的标准化萤火虫荧光素酶活性。当含有多个miR-21结合位点的荧光素酶报告质粒与常规线性miR-21抑制剂共转染时，萤火虫荧光素酶活性恢复。值得注意的是，当用我们的scRNA21共转染细胞时，观察到甚至更大的荧光素酶活性恢复。这些发现证实了scRNA21作为miR-21海绵的功能有效性。随后通过WST-1测定转染细胞显著降低的细胞增殖与显著增加的细胞凋亡。

    使用Tandem Mass Tag（TMT）标记进行泛蛋白质组学筛选得到6,314个单独蛋白质的列表。根据Ingenuity Pathway Analysis的目标预测，其中的235种代表了miR-21的推定的直接结合靶。235种蛋白中的19种增加了倍数变化。在scRNA21处理后，这些预测的直接miR-21靶标的蛋白质水平（其应被miR-21下调）恢复。在COSMIC共识癌基因列表中发现了这19种死亡域相关肿瘤抑制蛋白DAXX中只有1种。然后使用抗DAXX抗体进行蛋白质印迹。这些实验证实在scRNA转染两种GC细胞系NCI-N87和AGS后8小时恢复DAXX蛋白水平。这些数据证明了scRNA21针对特定miR-21下游靶肿瘤抑制基因的功能活性。

    在未来的研究中，我们将确认scRNA21对肿瘤生长的影响，研究scRNA21活性的潜在机制，并评估动物模型中的scRNA21毒性。尽管有这些潜在的缺陷，并考虑到oncomiRs在肿瘤发生和肿瘤进展中的关键作用，据我们所知，这些结果首次揭示了合成circRNA海绵作为抗癌研究和未来分子疗法的新工具的巨大前景。

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