Identification of ceRNA network based on a RNA‑seq shows prognostic lncRNA biomarkers in human lung adenocarcinoma

基于RNA-seq鉴定ceRNA网络显示人肺腺癌中预后的lncRNA生物标志物

    期刊：ONCOLOGY LETTERS

    发表单位：广州医科大学生命科学联合学院

    lnc/circRNA功能的一个重要机制是通过ceRNA结合miRNA调控靶基因表达。通过高通量测序或者芯片我们可以找到几百上千个差异表达的lnc/circRNA、mRNA、miRNA。每个分子都可能通过该机制发挥作用。构建所有重要分子的ceRNA网络有助于发现重要分子，网络中连接越多的分子，功能越重要。该如何构建ceRNA网络呢，以本文为例进行介绍。

    据报道，lncRNA用作竞争性内源RNA或miRNA海绵，通过在致瘤过程中竞争共同的miRNA来抑制miRNA反应元件（MRE）与mRNA交换。

    通过单变量回归和多变量Cox比例风险分析，32个基因与LUAD的存活相关。使用Miranda预测结合这些lncRNA的前27种mRNA靶向miRNA。接下来，将这些靶miRNA转移至TarBase，miRTarBase，miRecards和starBase v2.0数据库以获得其靶基因。根据先前的miRNA-mRNA和miRNA-lncRNA数据，基于29个预后mRNA建立了三个lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA网络，在LUAD中形成调节网络。

TCGA数据集和差异表达基因的分析

    TCGA网站获得包含512个LUAD和58个癌旁组织样品RNA-Seq数据。排除标准如下：1）组织学诊断不是LUAD；2）存在除LUAD之外的恶性肿瘤; 3）患者样本缺乏完整的分析数据。

    本研究共纳入493名LUAD患者。癌旁组织58个。此外，有170名LUAD患者有淋巴结转移，323名LUAD患者无淋巴结转移。381名I-II级LUAD患者和112名III-IV级LUAD患者。

    将lncRNA的表达数据转换为RPM。过滤低表达基因后，与GENCODE数据库相比，LUAD RNA-Seq数据包含20,321个mRNA和181个lncRNA。接下来，使用EdgeR和R的DEseq包（Padj<0.05且绝对log2FC>1）计数差异表达的lncRNA。使用两种方法取交集得到最终的lncRNA。(注意：TCGA包含miRNA/lncRNA/mRNA表达谱信息，很适合构建三者间的ceRNA。构建好网络后，挑选可靠分子进行ceRNA深入机制研究。如需各种肿瘤的ceRNA分析，可以联系我们)。

ceRNA的网络分析

    lncRNAs可以与miRNA结合并影响ceRNA功能。MiRanda用于预测lncRNA和miRNA之间的相互作用。miRanda主要基于circRNA和miRNA自由能量大小的组合：自由能越小，结合能力越强。在应用阈值最大能量≤-20且得分>160的过滤后，预测了许多与lncRNA结合的miRNA，但仅研究了具有前10个得分的miRNA（注意：本文先对临床资料做关联分析筛选到了29种重要mRNA和3种lncRNA。预测后筛选前10个miRNA。实际预测时很容易预测上百个miRNA。数据庞大。）。

    基于TarBase，miRTarBase，miRecards和starBase v2.0数据库，获得了关于ceRNA网络中microRNA的下游靶基因的信息。Cytoscape软件用于构建microRNA-target和microRNA-lncRNA整合网络。

    提取20,502个基因的表达数据，并使用R语言（EdegR和DESeq）计算表达数据。选择差异表达的基因（n=6280;表I）以进一步研究它们的预后值（图1）。

    Miranda预测了与三种lncRNA结合的microRNA，并且在阈值处获得了712种miRNA。根据预测的分数，本研究集中于27个miRNA，其中10个最高分（包括重复分数）与每个lncRNA结合。构建了包含715个节点和815个边缘的miRNA和lncRNA相互作用网络（图5）。

    基于TarBase，miRTarBase，miRecards和starBase v2.0数据库，获得上述27个关键miRNA的靶基因，构建microRNA-mRNA网络。该网络包含1,961个边线，27个microRNA和1,229个mRNA（816个上调，413个下调；图6）。此外，进行了网络中mRNA的GO BP富集分析（图7）。

    miRNA-mRNA和lncRNA-miRNA对用于构建lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA网络。分别提取29个先前的预后风险mRNA及其微小RNA，并建立调节网络。该网络还添加了lncRNAs，其调节潜在的miRNA，并构建了重要的lncRNA-miRNA-mRNA网络（图8）。如所证明的，hsa-miR-619-5p与三种预后风险因子具有调节关联。三种上调的mRNA和一种下调的mRNA可能受到lncRNA-ceRNA网络的影响。

    构建ceRNA机制网络需要至少三种分子lncRNA-miRNA-mRNA或circRNA-miRNA-mRNA。测序/芯片得到的差异表达的lnc/circRNA和mRNA比较多。除了考虑差异表达外，最好同时考虑其他因素对分子进行精简。比如本文考虑Cox多因素分析、KM生存分析、WGCNA分子间相关性等，同时考虑多软件预测取交集，预测后取得分值top10的分子。得到网络后，即可整体了解重要的分子（也就是节点较多的分子），进而挑选进行更深入的实验验证。

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